小鼠神经小胶质细胞的分离主要有新生鼠机械分离法（适合原代培养）和成年鼠流式分选法（适合高纯度单细胞获取）两种主流方案，以下是详细操作指南：

一、新生鼠机械分离法（原代培养）

适用于获取可用于长期培养的小胶质细胞，操作相对简单，成本低。

1. 材料准备

试剂：小鼠神经小胶质细胞完全培养基（MBM）、HBSS缓冲液、PBS、10% FBS DMEM培养基、多聚赖氨酸（包被用）、75%酒精

工具：尖头镊、弯镊、剪刀、冰盘、10cm/6cm培养皿、T75培养瓶、超净台

2. 操作步骤

培养皿包被：将多聚赖氨酸稀释为1×工作液，覆盖培养皿底部，室温孵育2小时或过夜，PBS洗涤2-3次备用。

取材与组织处理：

取出生2天内的新生鼠，75%酒精消毒后处死，用PBS漂洗2-3次。

剥离头部及脑壳，取出脑组织放入6cm培养皿；在解剖镜下去除嗅球、小脑及大脑半球连接物，仅保留皮层组织。

用尖头镊将皮层夹碎至浆糊状，用10% FBS DMEM培养基稀释后，接种至包被好的T75培养瓶（3个脑袋/T75瓶）。

培养与换液：

初始培养3天后，更换为神经小胶质细胞完全培养基，之后每周换液1次，约1周后细胞长满。

3. 细胞鉴定

形态观察：贴壁生长，呈梭形或多角形，属于终末分化、低增殖活性的细胞。

标志物鉴定：通过CD11b免疫荧光染色，纯度可达90%以上。

二、成年鼠流式分选法（高纯度单细胞获取）

适用于需要高纯度小胶质细胞进行流式、单细胞测序等下游实验，纯度更高但成本较高。

1. 材料准备

抗体：ACSA2、CD11b、CD45（用于流式标记）

试剂：PBS、1% BSA、EDTA、DNAse I、流式细胞术缓冲液

工具：流式细胞仪、手术器械、冰盒

2. 操作步骤

小鼠灌注与取脑：

用PBS彻底穿心灌注成年小鼠，处死后剥离头骨软组织，取出完整脑组织。

将脑组织置于预冷的流式缓冲液（含1% BSA、EDTA、DNAse I）中，轻柔研磨制成单细胞悬液。

流式标记与分选：

用ACSA2、CD11b、CD45抗体对细胞表面标志物进行标记，通过流式细胞仪圈门：

小胶质细胞典型表型：CD11b⁺CD45^med^（区别于单核细胞来源的巨噬细胞CD11b⁺CD45^high^）。

通过FACS分选获得高纯度小胶质细胞。

3. 核心优势

可精准区分小胶质细胞与外周浸润的巨噬细胞，纯度可达95%以上。

适用于疾病模型（如神经退行性疾病、脑炎）中激活态小胶质细胞的研究。

三、关键注意事项

无菌操作：全程在超净台中操作，培养基、试剂需提前灭菌，避免污染。

温度控制：脑组织处理全程在冰上进行，防止细胞活性下降。

标志物选择：流式分选需结合CD11b、CD45、ACSA2等多重标志物，避免髓质细胞污染。

伦理合规：实验需遵循动物伦理规范，使用合规麻醉/处死方法。